Ten pierwszy przypadek manipulacji genetycznej u jaszczurki stworzył organizm modelowy, który może pomóc w zrozumieniu ewolucji i rozwoju gadów
CRISPR-Cas9, lub po prostu CRISPR, to unikalne, szybkie i niedrogie narzędzie do edycji genów , które umożliwia edycję genomu poprzez usuwanie, dodawanie lub modyfikowanie DNA . Skrót CRISPR pochodzi od słów „Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats” (Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats). To narzędzie jest proste i bardziej precyzyjne niż poprzednie metody edycji DNA.
Narzędzie CRISPR-Cas9 wstrzykuje organizmom w stadium zygoty (pojedynczej komórki) konstrukt DNA składający się z (a) enzymu Cas9, który działa jak „nożyczki” i może przeciąć lub usunąć fragment DNA, (b) przewodnika RNA – sekwencji, która pasuje do genu docelowego i w ten sposób kieruje enzym Cas9 do miejsca docelowego. Po przecięciu docelowego fragmentu DNA, mechanizm naprawy DNA komórki ponownie połączy pozostałą nić i w tym procesie wyciszy docelowy gen. Gen może również zostać „skorygowany” poprzez użycie nowego zmodyfikowanego szablonu DNA w procesie zwanym naprawą kierowaną homologią. Zatem narzędzie CRISPR-Cas9 umożliwia modyfikacje genetyczne poprzez wstrzyknięcie roztworów do edycji genów do zapłodnionej komórki jajowej. Proces ten powoduje zmianę genetyczną (mutację) we wszystkich kolejnych komórkach, które powstają, wpływając w ten sposób na funkcję genu.
Chociaż CRISPR-Cas9 jest rutynowo stosowany u wielu gatunków, w tym ryb, ptaków i ssaków, jak dotąd nie odniósł sukcesu w genetycznej manipulacji gadów. Wynika to przede wszystkim z dwóch barier. Po pierwsze, samice gadów długo przechowują plemniki w jajowodach, co utrudnia określenie dokładnego czasu zapłodnienia. Po drugie, fizjologia jaj gadów ma wiele cech, takich jak giętkie skorupki jaj, kruchość bez przestrzeni powietrznej wewnątrz, co utrudnia manipulowanie zarodkami bez powodowania pęknięcia lub uszkodzenia.
W artykule opublikowanym na stronie bioRxiv 31 marca 2019 roku naukowcy poinformowali o opracowaniu i przetestowaniu po raz pierwszy metody edycji genów CRISPR-Cas9 u gadów. Gatunkiem gada wybranym do badania była tropikalna jaszczurka o nazwie Anolis sagrei , częściej anolis brunatny, szeroko rozpowszechniona na Karaibach. Jaszczurki biorące udział w badaniu zostały zebrane z dzikiego regionu Florydy w USA. Gatunek ten idealnie nadaje się do badania ze względu na miniaturowe rozmiary, długi sezon rozrodczy i stosunkowo krótki średni czas między dwoma pokoleniami.
Aby przezwyciężyć ograniczenia, z jakimi borykają się obecnie gady, naukowcy wstrzyknęli składniki CRISPR do niedojrzałych, niezapłodnionych jaj, podczas gdy jaja jeszcze przed zapłodnieniem znajdowały się w jajnikach samic jaszczurek. Celowali w gen tyrozynazy, który wytwarza enzym kontrolujący pigmentację skóry u jaszczurek i jeśli ten gen zostanie usunięty, jaszczurka urodzi się albinosem. Ten wyraźny fenotyp pigmentacji był powodem wyboru genu tyrozynazy. Jaja poddane mikroiniekcji dojrzewają następnie wewnątrz samicy, a następnie są naturalnie zapładniane wprowadzonym samcem lub zmagazynowanym nasieniem.
W rezultacie, kilka tygodni później urodziły się cztery jaszczurki albinotyczne, co potwierdziło dezaktywację genu tyrozynazy i powodzenie procesu edycji genu . Ponieważ potomstwo zawierało zmodyfikowany gen od obojga rodziców, było jasne, że komponenty CRISPR pozostawały aktywne znacznie dłużej w niedojrzałym oocycie matki, a po zapłodnieniu zmutowały geny ojcowskie. Zatem zmutowane jaszczurki albinotyczne wykazywały zmanipulowaną tyrozynazę w genach odziedziczonych zarówno po matce, jak i po ojcu, ponieważ albinizm jest cechą dziedziczoną po obojgu rodzicach.
Jest to pierwsze w historii badanie, w którym skutecznie produkowano genetycznie zmodyfikowane gady. Badania mogłyby działać w podobny sposób na innych gatunkach jaszczurek, takich jak węże, w przypadku których dotychczasowe podejście nie przyniosło skutku. Prace te mogą pomóc w zrozumieniu ewolucji i rozwoju gadów.
***
Źródło (s)
Rasys AM i in. 2019. Preprint. Edycja genu CRISPR-Cas9 u jaszczurek poprzez mikroiniekcję niezapłodnionych oocytów. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
***
